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La Galería Palatina, situada en el piano nobile del palacio, es probablemente el más famoso conjunto que en su día formase parte de las famosas colecciones mediceas. Este museo de 28 salas, que atraviesa los apartamentos reales, contiene obras de Botticelli, Fra Bartolomeo, Rafael (Madona de la silla, La Dona Velata, Madonna del granduca...), Andrea del Sarto (Anunciación Della Scala, San Juan Bautista), Tiziano, Correggio, Jacopo Pontormo, Domenico Beccafumi, Caravaggio, Rubens (Los cuatro filósofos), Artemisia Gentileschi y Pietro da Cortona, entre otros. Sigue manteniendo la apariencia de una colección privada, pues las obras de arte están dispuestas a la manera de un palacio, en vez de la colocación típica de los museos.
Las principales estancias fueron decoradas por Pietro da Cortona en puro estilo barroco, que pintó frescos en siete salas del palacio. De hecho, se considera uno de sus mejores trabajos la inmensa serie de frescos de la Sala della Stuffa (1637- 1642), que representan la Edad del Oro, la Edad de la Plata, la Edad del Cobre y la Edad del Hierro, y las Salas de Marte, Júpiter y Venere (1647), que sirvieron de modelos para los Salons des Planétes de Charles Le Brun en el Palacio de Versalles. El resto de los cuartos fueron completados a lo largo del siglo XVII por Ciro Ferri.
La colección se abrió al público por primera vez al final del XVIII por el Gran Duque Pietro Leopoldo, que quería obtener la popularidad tras el fin de la dinastía Médici.
